بررسی بیش بیان ژن sox2 به¬وسیله ناقل ویروسی aav-2 در سلول¬های rpe انسان بالغ

اپیتلیوم رنگدانه¬دار شبکیه چشم(rpe) یک تک لایه شامل سلول¬هایی است که نورون¬های شبکیه را محافظت می¬کنند. در طول تکوین، rpe و نورون¬های شبکیه از یک پیش¬ساز مشترک به¬نام حباب بینایی منشا می-گیرند. sox2 یک فاکتور رونویسی است که حاوی جعبه hmg است و از ژن¬های مهم در تکوین چشم می¬باشد که دیده شده در شرایط مناسب، تمایززدایی سلول¬های rpe را القا می¬کند. هدف از این مطالعه سنجش توانایی sox2 انتقال¬یافته توسط ویروس وابسته به¬آدنو(aav) در ایجاد تغییرات تمایزی سلول¬های rpe انسان بالغ می¬باشد. مواد و روش¬ها: توالی کدکننده ژن sox2 در وکتور paav-mcs همسانه¬سازی و توسط روش¬های colony pcr، هضم آنزیمی و تعیین توالی، تایید شد. جهت رهگیری بیان ژن در سلول¬های جانوری، قطعه ires-egfp نیز در وکتور بیانی همسانه¬سازی شد. محصول واکنش اتصال به باکتری e.coli منتقل و باکتری¬های تراریخت توسط آزمون استخراج quick check مشخص و با روش¬های هضم آنزیمی، واکنش زنجیره¬ای پلیمراز و تعیین توالی وکتور بیانی نهایی تایید شد. با استفاده از وکتور گزارشگر paav-lacz ترنسفکشن سلول¬های hek293t به روش کلسیم فسفات بهینه شد و این سلول¬ها توسط وکتور نوترکیب حاوی sox2-ires-egfp، paav-rc و phelper ترنسفکت همزمان شدند. ویروس¬های نوترکیب پس از 72 ساعت جمع¬آوری شدند. از سه روش رنگ¬آمیزی x-gal، فلوسایتومتری و absolute quantification real-time pcr جهت تعیین تیتر ویروس¬های مختلف تولیدشده استفاده شد. کره¬های چشم انسان بالغ از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران فراهم و سلول¬های rpe جداسازی و کشت داده¬شدند. این سلول¬ها توسط ویروس-های نوترکیب به روش¬های مختلفی آلوده¬شدند. جهت بررسی تغییرات بیان sox2 و پیامدهای حاصل از آن، آزمون¬های real-time pcr و ایمنوسیتوشیمی استفاده شدند. نتایج: داده¬های حاصل از تعیین تیتر ویروس نشان داد استوک اولیه ویروس¬های aav-sox2 جمع¬آوری شده دارای106×8/1 ویروس با توانایی آلوده¬سازی بود. روش آلوده¬سازی سلول¬های شناور به عنوان بهترین روش آلوده¬سازی سلول¬های rpe انتخاب شد. تجزیه تحلیل داده¬های حاصل از real-time pcr نشان داد پس از مهار تکثیر سلولی، به¬دنبال افزایش بیان sox2، نستین به عنوان نشانگر سلول¬های پیش¬ساز عصبی، در سلول¬های آلوده¬شده با ویروس نوترکیب حاوی sox2 افزایش بیان پیدا می¬کند. همچنین ژن pax6 نیز تغییرات بیان معنادار باسطح اطمینان 99% نشان داد. در آزمون ایمنوسیتوشیمی بروز سلول¬های مثبت برای نشانگرهای تمایزی مانند thy1 که نشانگر سلول¬های گانگلیونی است مشاهده شد. همچنین برای اولین بار نتایج ایمنوسیتوشیمی این تحقیق تغییرات rpe به سمت سلول گیرنده نور استوانه¬ای را تحت تاثیر sox2 نشان داد. در نهایت نتایج این تحقیق نشان داد که افزایش بیان sox2 سبب القا تغییرات تمایزی سلول¬های rpe انسان بالغ می¬شود.